粗粉加工设备

　　帕金森病（ Parkinson’s disease ， PD ）是当前世界范围内最常见的神经退行性疾病之一 [1] ，其主要病理特征为中脑黑质 - 纹状体通路出现多巴胺（ dopamine ， DA ）能神经元的进行性退化。 PD 患者会出现静止性震颤、运动迟缓等运动症状 [2] ，以及睡眠障碍、胃肠道功能障碍等非运动症状 [3] 。有 30% 的 PD 患者在运动功能障碍和中枢神经系统（ central nervous system ， CNS ）疾病出现前就出现肠道神经系统（ enteric nervous system ， ENS ）失调。在近些年的研究中，不断有证据为“ PD 可能是肠源性疾病”这一假说提供支持 [4] 。

　　中医“脾胃学说”与脑有着密切的联系，脾胃为气血生化之源，能升清降浊以营养全身，若其代谢失常，则脑神失养，导致众多脑病 [5] 。甘松为败酱科植物甘松 Nardostachys jatamansi DC. 的干燥根及根茎，是我国传统中药材，收录于《中国药典》 2020 年版一部 [6] ，入脾、胃经，有“醒脾”“行气”“健胃”等功效。马云枝教授认为脾虚湿阻、痰瘀互结是 PD 发生的主要病机，甘松既有“醒脾”之功，便有其统摄之效 [7] 。临床上常使用甘松与石菖蒲配伍治疗脾虚痰盛型原发性癫痫 [8] 。传统观点认为 PD 与“肝风”相关 [5] ， PD 患者久病则郁，有因病致郁，或因病使郁加重，甘松既有“行气”之功，便有其治疗之效。中医理论中，胃与脑通过经气直接相连，胃气的变动可以直接影响到脑的功能 [9] ，甘松既有“健胃”之功，便有其滋养之效。临床归纳甘松广泛应用于疏解久病之郁，调理脾胃之气，芳香避秽醒脑 [10] 。此外，现代药理学研究表明，甘松对各种神经、精神疾病有较好的神经保护作用 [11] ，包括抗 PD[12] 和阿尔兹海默 [13] 等神经退行性疾病、抗抑郁 [14] 和 镇静 [15] 等。

　　课题组前期研究发现甘松 80% 乙醇提取物可以调节 PD 大鼠肠道菌群，从而干预 PD 相关病理症状 [16] ，但尚缺乏基于中医基础理论探讨甘松抗 PD 机制的研究。因此，本研究拟采用鱼藤酮致大鼠 PD 模型，通过旷场实验、斜板实验以及大鼠纹状体 DA 含量考察不同剂量甘松 80% 乙醇提取物对 PD 大鼠运动障碍的改善能力，筛选甘松抗 PD 最优剂量；在“肠 - 脑轴”理论的指导下，采用 Western blotting 和 ELISA 实验检测 PD 大鼠结肠和纹状体中神经递质的含量、肠道胶质细胞标志物和神经胶质细胞标志物的表达情况，探究甘松抗 PD 的作用机制，为将“脾胃学说”和“肠 - 脑轴”理论相结合治疗 PD 的研究奠定基础。

　　SPF 级 SD 雄性大鼠，体质量 200 ～ 220 g ，由维通利华（北京）实验技术有限公司提供，动物许可证号 SCXK （京） 2016-0006 ，饲养于北京中医药大学实验动物部标准屏障环境内，自由饮食，明暗节律 12 h/12 h 。进行实验前，大鼠给予不受限制的标准饲料和洁净饮用水。动物实验遵守国际实验动物伦理学要求，已由动物伦理委员会批准，批准编号为 BUCM-4-2020091407-3055 。

　　甘松药材购自四川阿坝若尔盖县，经北京中医药大学中药鉴定教研室石晋丽教授鉴定为败酱科缬草属植物甘松 N. jatamansi DC. 的干燥根及根茎。

　　SB-5200DTD 型超声清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）； ME104E/02 型十万分之一电子天平 [ 梅特勒 - 托利多国际贸易（上海）有限公司 ] ； FW-200 型高速万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司）； HW.SY21-KP4 型智能恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司）； RE-52AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）； JY96-IIN 型细胞粉碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；旷场、斜板均为实验室自制。

　　将甘松药材粉碎成粗粉，称取 100 g 置于具塞锥形瓶中，分别用 10 、 8 、 8 倍量的 80% 乙醇超声提取 3 次，时间分别为 60 、 45 、 45 min ，温度控制在 35 ℃以下，滤过，合并滤液，减压回收溶剂，得棕色浸膏 10.5 g ，出膏率为 10.5% ，冷冻真空干燥。甘松醇提物中主要含有萜类、黄酮类和香豆素类化合物，其中倍半萜类成分甘松新酮的质量分数为 0.109% ～ 2.013% ，总黄酮质量分数为 1.01% ～ 2.18%[17] 。

　　将鱼藤酮粉末溶于葵花籽油中，配成 1.5 mg/mL 的乳化液， SPF 级 SD 大鼠适应性饲养 1 周后，连续 2 周颈背部 sc 鱼藤酮（ 1.5 mg/kg ），选取 PD 评分 2 ～ 4 分大鼠纳入实验，评分标准见表 1 。按照评分标准筛选造模成功的大鼠，少数大鼠对鱼藤酮较为敏感，中毒症状严重，出现瘫痪、不能进食等危害生命的症状，基于动物伦理的考虑，对 6 ～ 8 分大鼠进行及时处死。

　　将造模成功的大鼠随机分为模型组、左旋多巴组和甘松低、中、高剂量组，每组 7 ～8 只，另设置对照组大鼠8 只。以前期课题组对甘松不同溶剂提取物抗大鼠帕金森运动功能研究中所用剂量作为中剂量[18] ，另设低、高剂量，分别为中剂量的2/3 、3/2 倍，即分别为0.41 、0.62 、0.93 g/kg 生药。左旋多巴类药物是临床治疗PD 的首选药物[19] ，能有效缓解PD 患者的运动功能障碍，故左旋多巴组为阳性对照组，根据左旋多巴临床用量确定给药剂量50 mg/kg 。

　　2.4.1 旷场实验 选择规格为100 cm ×100 cm ×45 cm 的正方形箱作为旷场，将其底部划分为25 个方格（20 cm ×20 cm ），将大鼠置于旷场实验箱正中央，观察大鼠在5 min 内旷场自由活动的总路程。大鼠运动总路程越长，证明运动功能障碍越小。

　　2.4.2 斜板实验 参照Rivlin 等[20] 方法自制斜板，斜板由2 个矩形木板靠铰链连接，作为底板的木板不动，通过铰链连接另一块可活动木板，上附1 cm 厚的橡胶垫。将大鼠头朝上，垂直放于可活动木板的橡胶垫上，从夹角为50 °开始，若大鼠可在斜板上停留5 s ，则升高斜板角度5 °，直至停留时间小于5 s ，记录此角度作为斜板停留角度。每只大鼠测量3 次，取测量平均值。大鼠停留角度越高，证明运动功能障碍越小。

　　行为学实验结束后，各组大鼠禁食、不禁水12 h ，ip 20% 乌拉坦，剪开大鼠的胸腔，将灌注针插入心脏左心室，剪开右心耳进行心脏灌注操作。在冰上迅速剥离出完整的大脑，浸泡于10 倍体积的多聚甲醛溶液中静置24 h 。然后进行石蜡包埋，冠状面切片，梯度酒精脱水，染色，拍照，并将图片导入至Image J 软件中，对阳性细胞的吸光度（A ）值及区域总面积的比值进行分析，得到TH 的平均A 值，以确定其表达情况。

　　将大鼠结肠、纹状体组织用 4 ℃ 的PBS 缓冲液漂洗3 次，加入10 倍体积的组织蛋白提取试剂，置于匀浆器中匀浆，待匀浆液完全裂解，收集上清液，使用BCA 定量法对蛋白总浓度进行测定。蛋白样品经十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，TBST 洗涤，用5% 脱脂牛奶封闭1 h ，TBST 洗涤3 次，每次5 min ；加入一抗（1 ∶6000 ），4 ℃ 孵育过夜；TBST 洗涤3 次，每次5 min ，加入二抗（1 ∶50 000 ），室温孵育30 min ，TBST 洗涤4 次，每次5 min 。采用ECL 化学发光法显影，使用Image J 分析蛋白条带灰度值。

　　数据应用 GraphPad Prism 9.0 软件进行统计学分析，计量资料以 表示，实验结果服从正态分布时，组间比较采用单因素方差分析，差异有显著性时利用Dunnett’s 检验进行多重比较分析。

　　3.1.1 甘松对 PD 大鼠旷场实验的影响 如表2 所示，与对照组比较，模型组大鼠旷场总运动距离显著缩短（P ＜0.001 ）；与模型组比较，各给药组大鼠旷场总运动距离均显著增加（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ），其中甘松中剂量组最佳，表明甘松中剂量组对PD 大鼠自主活动能力的改善最为显著。

　　3.1.2 甘松对 PD 大鼠斜板实验的影响 如表 3 所示，与对照组比较，模型组大鼠上肢力量不足、停留角度显著降低（ P ＜ 0.001 ）；与模型组比较，各给药组大鼠上肢协调能力显著改善，斜板停留角度显著升高（ P ＜ 0.01 、 0.001 ），其中甘松中剂量组最佳， 表明甘松中剂量组对 PD 大鼠运动协调能力的改善最为显著。

　　3.1.3 甘松对 PD 大鼠纹状体 DA 含量的影响 如表4 所示，与对照组比较，模型组大鼠纹状体中DA 含量显著降低（P ＜0.001 ）；与模型组比较，各给药组大鼠纹状体DA 含量显著升高（P ＜0.05 、0.01 、0.001 ），其中甘松中剂量组作用最佳。

　　3.2.1 甘松对 PD 大鼠黑质 TH 表达的影响 如图1 、表5 所示，模型组大鼠中脑黑质区域TH 阳性神 经元表达明显下降（ P ＜ 0.05 ），胞体轮廓不清晰且胞体显著缩小；经左旋多巴给药后， PD 大鼠 TH 阳性表达明显升高（ P ＜ 0.05 ），胞体缩小较少；经甘松给药后， PD 大鼠 TH 阳性表达显著升高（ P ＜ 0.01 ），表明甘松可有效抑制 PD 大鼠黑质 TH 阳性神经元的减少。

　　3.2.4 甘松对 PD 大鼠肠神经胶质细胞的影响 如图 2 、表 8 所示，与对照组比较，模型组大鼠结肠组织 Iba-1 、 GFAP 蛋白表达水平均显著升高（ P ＜ 0.001 ）；与模型组比较，各给药组结肠组织 Iba-1 、 GFAP 蛋白表达水平均显著降低（ P ＜ 0.001 。

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